Vielen Dank für Ihren Besuch auf nature.com.Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung.Um die beste Erfahrung zu erzielen, empfehlen wir Ihnen, einen aktuelleren Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren).In der Zwischenzeit zeigen wir die Website ohne Stile und JavaScript an, um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten.Karussell mit drei Dias, die gleichzeitig angezeigt werden.Verwenden Sie die Schaltflächen Zurück und Weiter, um durch drei Folien gleichzeitig zu navigieren, oder die Schaltflächen mit den Folienpunkten am Ende, um jeweils drei Folien zu überspringen.Chenming Xu, Jianli Li, … Jinglan ZhangJinglan Zhang, Jianli Li, … Christine M. EngMichelle M. Clark, Zornitza Stark, … Stephen F. KingsmoreJana Weymaere, Ann-Sophie Vander Plaetsen, … Filip Van NieuwerburghNicholas M. Murphy, Tanya S. Samarasekera, … Luk JF RombautsHuili Xue, Aili Yu, … Hailong HuangMonica H. Wojcik, Rebecca Reimers, … Pankaj B. AgrawalFrançois Rousseau, Sylvie Langlois, … Guy RouleauMartin Sauk, Olga Žilina, … Lauris Kaplinskinpj Genomic Medicine Band 7, Artikelnummer: 74 (2022 ) Diesen Artikel zitierenDie RNA-Sequenzierung (RNA-seq) ist in der Gendiagnostik auf dem Vormarsch, da sie eine funktionelle Unterstützung für die Interpretation von Varianten ungewisser Bedeutung bietet.Die Verwendung von Fruchtwasser (AF)-Zellen für RNA-seq wurde jedoch noch nicht untersucht.Hier untersuchten wir die Expression klinisch relevanter Gene in AF-Zellen (n = 48) im Vergleich zu Vollblut und Fibroblasten.Die Anzahl der gut exprimierten Gene in AF-Zellen war vergleichbar mit der in Fibroblasten und viel höher als die im Blut über verschiedene Krankheitskategorien hinweg.Wir fanden, dass die RNA-seq von AF-Zellen in der pränatalen Diagnose (n = 4) machbar und vorteilhaft ist, da Transkriptomdaten die molekularen Konsequenzen aufklärten, die zur Erhöhung der Pathogenität von Varianten in CHD7 und COL1A2 führten, und die In-silico-Vorhersage einer Variante in MYRF revidierten.AF-Zellen-RNA-seq könnte eine vernünftige Wahl für postnatale Patienten werden, mit Vorteilen gegenüber Fibroblasten und Blut, da sie invasive Eingriffe verhindert.Varianten von unsicherer Signifikanz (VUSs) machen einen großen Anteil der Gesamtvarianten aus und reichen je nach Gen von 40–64 %1,2,3.Die meisten VUS sind selten4;daher ist ihre Interpretation herausfordernd und kann eine schnelle genetische Diagnose von Mendelschen Krankheiten behindern.In der Praxis werden seltene VUSs, insbesondere solche in regulatorischen Regionen, mit der zunehmenden Erschwinglichkeit und Zugänglichkeit von Whole-Exome-Sequencing (WES) und Whole-Genome-Sequencing (WGS)5 häufiger auftreten.Eine Fülle laufender Forschungen in den Bereichen Metabolomik, Proteomik, Methylprofilierung, In-vitro- oder In-vivo-Funktionsstudien und Transkriptom-/RNA-Sequenzierung (RNA-seq) hat versucht, die Komplexität bei der Interpretation von VUS6,7,8,9 anzugehen.Die Fähigkeit von RNA-seq, gleichzeitig alle exprimierten Transkripte in einem bestimmten Gewebe zu untersuchen, stellt es an die Spitze der Verbesserung der pathogenen Klassifizierung von Varianten10.RNA-seq entwickelt sich zu einem direkten und nützlichen Werkzeug für genetische Diagnosen, da es funktionelle Vorteile bietet und die Interpretation von VUS unterstützt.Während WES und WGS eine genetische Diagnoserate von 25–55 % über ein breites Spektrum von Mendelschen Störungen erreicht haben11,12,13, wird geschätzt, dass RNA-seq als komplementäre diagnostische Plattform die Diagnoserate um 6–36 % erhöht, mit einer erwarteten durchschnittlichen Steigerung von 21 %6,14,15,16,17,18,19,20,21.Die Schwankungen in der Ausbeute hängen von den Auswahlkriterien, der Krankheitskategorie und den verwendeten Geweben ab.Kürzlich entwickelten Yépez et al.22 einen modularen Rechenablauf, die „Detection of RNA Outliers Pipeline“ (DROP), der alle grundlegenden RNA-seq-Analyseschritte für robuste klinische Diagnosen integriert.DROP wurde in zwei neueren Studien mit einer Diagnoserate von 16 %18,21 implementiert;Keine dieser Studien konzentrierte sich jedoch auf pränatale Diagnosen.Bis heute gibt es begrenzte RNA-seq-Daten zu Fruchtwasserzellen (AF)23,24.Dem Genotype-Tissue Expression (GTEx)-Konsortium25, das gewebespezifische Genexpressionsniveaus für über 50 Referenz-/nicht erkrankte Gewebetypen katalogisiert hat25, fehlen Informationen zu AF-Zellen.Obwohl sich frühere Studien auf RNA-seq in zellfreien (cf) Transkriptomen23,26,27 konzentrierten, haben andere über die Nachteile von cfRNA berichtet, einschließlich der leichten Kontamination mit Wildtyp-DNA aus der Leukozytenlyse und der kurzen Halbwertszeit.Für optimale Ergebnisse wird die Verwendung von Spezialröhrchen mit kurzer Verarbeitungszeit empfohlen28.Darüber hinaus ist cfRNA für Transkripte mit niedrigen Konzentrationen sehr variabel;Daher ist ein standardisierter Flüssigbiopsie-Workflow erforderlich, was die klinische Implementierung erschwert.Vorhofflimmern mittels Amniozentese ist der bevorzugte diagnostische Test, wenn fetale Anomalien bei der Ultraschalluntersuchung festgestellt werden.Der relativ leichte Zugang zu diesen Proben in Labors macht RNA aus AF-Zellen zu einer bequemeren Wahl als cfRNA.Darüber hinaus können gespeicherte AF-Zellenproben später für weitere Untersuchungen nach der Geburt abgerufen werden.Die Chorionzottenbiopsie (CVS) hat zwar die gleichen oder sogar noch bessere Vorteile hinsichtlich früher Zugänglichkeit und zeitnaher Entscheidungsfindung;CVS ist jedoch vergleichsweise indirekt, da es aus der Plazenta stammt, im Gegensatz zu Amnionzellen, die aus dem Epiblast stammen, der sich schließlich zum Embryo entwickelt29.Vollblut kann wohl als der routinemäßig am häufigsten verwendete Probentyp für postnatale RNA-seq angesehen werden, es wird jedoch vermutet, dass Hautfibroblasten Vollblut zum Nachweis der RNA-Expression vorzuziehen sind, da sie eine viel höhere Anzahl gut exprimierter Gene enthalten18.Die Gewinnung von Fibroblasten aus Hautbiopsien ist jedoch ein invasives Verfahren, das AF-Zellen zu einer besseren Option für RNA-seq in postnatalen Umgebungen macht.Der embryonale Ursprung von AF ähnelt dem von Hautfibroblasten aufgrund der konstanten bidirektionalen Diffusion zwischen AF und Fötus über die unverhornte Haut während der frühen Embryonalentwicklung30.Da sich die Grundstruktur der Epidermis unmittelbar nach der Befruchtung entwickelt, enthält AF alle Hautbestandteile, bis die fötale Haut in etwa der 25. Schwangerschaftswoche vollständig verhornt ist30,31,32,33.Angesichts der Ähnlichkeiten im embryonalen Ursprung von VHF und Hautfibroblasten stellten wir die Hypothese auf, dass VHF-Zellen, die während des zweiten Trimesters (16–24 Wochen) gewonnen wurden, eine große Anzahl von Genen exprimieren könnten, ähnlich wie Hautfibroblasten18.Diese Studie verglich daher die Expression klinisch relevanter Gene in AF-Zellen mit der in Blut- und Hautfibroblasten und untersuchte die Möglichkeit der Verwendung von AF-Zellen für RNA-seq sowohl im pränatalen als auch im postnatalen Umfeld.Wir haben einen Ausreißeransatz mit DROP in der pränatalen Umgebung mit ausreichender Stichprobengröße für die genaue Erkennung von Spleiß- und Expressionsausreißern angewendet.Diese Pionierarbeit untersuchte den Beitrag der RNA-seq von AF-Zellen zur Molekulardiagnostik.Wir rekrutierten 52 Föten, davon 23 Weibchen und 29 Männchen.Alle 52 AF-Proben wurden von schwangeren Frauen mit einem Gestationsalter von 16 Wochen und 0 Tagen bis 21 Wochen und 3 Tagen zwischen August 2020 und Mai 2021 entnommen, mit Ausnahme einer AF-Probe, die aus einer Schwangerschaft im Jahr 2017 entnommen wurde. 48 AF-Proben dienen als nicht erkrankte Kontrollen und vier AF-Proben wurden zur Validierung verwendet.Der Sequenzierungstiefenbereich betrug 106–177 Millionen Reads pro Probe (Median: 121 Millionen).Im Durchschnitt erreichten 94 % der Basen einen Qualitätswert von Q30.Über 12.500 Gene haben die Qualitätsfilterung bestanden (Ergänzende Abb. 1).Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) der Expressionsprofile in GTEx-Vollblut, GTEx-Fibroblasten und unseren AF-Zellen ergab drei unterschiedliche Cluster, wobei AF-Zellen und Fibroblasten ähnliche Expressionsprofile aufweisen (Abb. 1).Unter den 2020 kuratierten Genen im Zusammenhang mit angeborenen und Entwicklungsstörungen (siehe Methoden) waren mehr als die Hälfte sowohl in AF-Zellen (51 %) als auch in Fibroblasten (58 %) gut exprimiert (medianes TPM ≥ 10), während weniger als 500 Gene ( 22%) waren im Vollblut gut exprimiert (Abb. 2a).AF-Zellen und Fibroblasten teilten die meisten gut exprimierten Gene, wobei 81 % (940/1168) überlappten (Abb. 2b).Nur 35 % (410/1168) der gut exprimierten Gene in Fibroblasten und 34 % (399/1168) der Gene in AF-Zellen wurden im Vollblut gefunden.Genexpressions-Zählmatrizen sowie die die Privatsphäre wahrenden Zählmatrizen von geteilten und nicht geteilten Reads, die annotierte Spleißstellen von RNA-seq überlappen, stehen ohne Einschränkungen zum Download aus dem Zenodo-Repository zur Verfügung (https://zenodo.org/record/7079684 #.YyLGoXZByUl).Die Top-1000-Gene mit der größten Varianz zwischen GTEx-Vollblut, GTEx-Fibroblasten und AF-Zellen wurden verwendet, um dieses Diagramm zu erstellen.Das entsprechende PCA-Diagramm mit zusätzlichen Geweben (d. h. Vollblut von 125 lebenden Teilnehmern, 803 GTEx-Muskelproben und 330 Proben induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSC)) ist in der ergänzenden Abb. 6 dargestellt.a Anzahl gut exprimierter (Median TPM ≥ 10), schwach exprimierter (1 ≤ TMP < 10) und nicht exprimierter (Median TPM < 1) Gene unter den 2.020 Genen, die mit angeborenen und Entwicklungsstörungen im GTEx-Vollblut assoziiert sind (n = 504), GTEx-Fibroblasten (n = 755) und AF-Zellen (n = 48).b Venn-Diagramm von Genen, die in Vollblut, Fibroblasten und AF-Zellen unter den 2020-Genen gut exprimiert sind.c Genexpression in AF-Zellen und Fibroblasten von 26 Genen, die nicht im Vollblut exprimiert werden.Diese Gene waren innerhalb der pränatalen Kohorte von 610 Föten in der PAGE-Studie34 diagnostisch oder potenziell klinisch nützlich (dh sie zeigten eine pathogene/wahrscheinlich pathogene/VUS-Variante).Rote gepunktete Linie zeigt den Cut-off bei median TPM ≥ 10. d Expression von 13 Genen in AF-Zellen und Fibroblasten, die nicht im Vollblut exprimiert wurden.Dies waren wiederkehrende diagnostische Gene in der DDD-Studie35,36.Die rote gepunktete Linie zeigt den Grenzwert bei einem mittleren TPM ≥ 10. e Anteile gut exprimierter Gene in 11 Genklassen über GTEx-Vollblut, GTEx-Fibroblasten und AF-Zellen.TPM-Transkript pro Million Reads, AF Fruchtwasser, ns statistisch nicht signifikant;** p ≤ 0,01;*** p ≤ 0,00.Von den 2020 kuratierten Genen wurden 61 innerhalb der pränatalen Kohorte von 610 Föten in der groß angelegten Prenatal Assessment of Genomes and Exomes (PAGE)-Studie als diagnostisch oder potenziell klinisch nützlich (d. h. mit einer pathogenen/wahrscheinlich pathogenen/VUS-Variante) betrachtet34 .Von diesen 61 Genen wurden 26 nicht im Vollblut exprimiert (Median TPM < 1), während über 50 % in AF-Zellen oder Fibroblasten (mit Median TPM ≥ 1) nachgewiesen werden konnten, wodurch die Machbarkeit von RNA-seq bei AF weiter gestärkt wird Zellen für pränatale Diagnostik (Abb. 2c).Vier Gene (SOX9, TFAP2A, CCDC103 und DNAH11) wurden in AF-Zellen signifikant stärker exprimiert als in Fibroblasten.In ähnlicher Weise waren 54 der Gene des Jahres 2020 rezidivierende diagnostische Gene mit potenziell signifikanten Auswirkungen auf die postnatale genetische Diagnose gemäß der groß angelegten Studie „Deciphering Developmental Disorders“ (DDD)35,36.Davon wurden 13 Gene nicht im Vollblut exprimiert (mediane TPM < 1), fünf bzw. sieben Gene wurden in Fibroblasten bzw. AF-Zellen exprimiert (mediane TPM ≥ 1).Die Expression von SCN8A, NALCN, SATB2, TCF4 und STXBP1 wurde in Fibroblasten nachgewiesen, während die Expression von SCN8A, NALCN, KIF1A, PAK3, SATB2, TCF4 und STXBP1 in AF-Zellen nachgewiesen wurde (Abb. 2d).Bemerkenswerterweise wurde STXBP1, das zu sechs Diagnosen in der DDD-Studie35,36 beitrug, sowohl in Fibroblasten als auch in AF-Zellen gut exprimiert.Die ergänzenden Tabellen 3–5 fassen die Expressionsniveaus aller 2.020 Gene zusammen, die mit angeborenen und Entwicklungsstörungen assoziiert sind.Sowohl GTEx-Fibroblasten als auch AF-Zellen hatten einen höheren Anteil gut exprimierter Gene in allen 11 Krankheitsgenklassen als GTEx-Vollblut (Abb. 2e).Es gab statistisch signifikante p-Werte für alle 11 Genklassen mit Ausnahme von zwei, was wahrscheinlich auf die geringere Anzahl von Genen zurückzuführen war, die in diesen Genklassen enthalten waren (15 und 30 Gene).Die Mehrheit der gut exprimierten Gene hatte in allen Genklassen eine höhere Expression in Bezug auf den mittleren und maximalen TPM in Fibroblasten und AF-Zellen als in Vollblut.Fibroblasten hatten in allen Klassen den höchsten Anteil an gut exprimierten Genen, mit Ausnahme der „familiären nicht-syndromalen angeborenen Herzkrankheit“, bei der AF-Zellen den höchsten Anteil an gut exprimierten Genen aufwiesen (wenn auch nicht signifikant).Eine Gene Ontology (GO)-Anreicherungsanalyse37 von 81 Genen, die in AF-Zellen gut exprimiert, aber nicht exprimiert oder schwach in Vollblut und Fibroblasten exprimiert wurden, gruppierte 244 signifikante GO-Begriffe (FDR q-Wert < 0,1) in einem Netzwerk von 20 Clustern (Ergänzungstabelle 6).Alle 20 Cluster enthielten Begriffe, die sich auf die frühe Organ- oder Systementwicklung und Morphogenese bezogen.Die obersten drei angereicherten Cluster (q-Wert < 3,9 × 10−4) wurden durch die GO-Terme (i) embryonale Morphogenese, (ii) Entwicklung der Herzkammer und (iii) Entwicklung der Sinnesorgane dargestellt.Da die GO-Analyse eine potenzielle Anreicherung von Herzgenen in AF-Zellen anzeigte, verglichen wir weiter die Gesamtexpression dieser Gene (gut exprimiert und schwach exprimiert; n = 33) in Vollblut, Fibroblasten und AF-Zellen.Die Gesamtzahl der exprimierten Herzgene war zwischen Fibroblasten (20/33) und AF-Zellen (19/33) vergleichbar, war jedoch in Vollblut (11/33) viel höher (ergänzende Abb. 3a).Von den 33 Herzgenen wurden 45 % (15/33) in AF-Zellen als gut exprimiert angesehen, gefolgt von 39 % (13/33) in Fibroblasten und 21 % (7/33) in Vollblut (ergänzende Abb. 4a ).Wir haben einen ähnlichen Vergleich mit 423 Skelettgenen durchgeführt, da Skelettanomalien einen der Top-Phänotypen mit den größten Anteilen an diagnostischen genetischen Varianten während der pränatalen WES darstellen, wie durch mehrere groß angelegte pränatale Kohortenstudien dargestellt wird34,38,39.Darüber hinaus ist es einer der häufigsten Phänotypen mit einer genetischen Diagnose in früheren postnatalen WES-Studien40,41.Die Gesamtzahl gut exprimierter und schwach exprimierter Skelettgene war in Fibroblasten (339/423) und AF-Zellen (337/423) vergleichbar, aber viel höher als in Vollblut (236/423) (ergänzende Abb. 3b). .Fibroblasten, AF-Zellen und Blut wiesen 61 % (259/423), 50 % (210/423) und 18 % (78/423) gut exprimierte Skelettgene auf (ergänzende Abb. 4b).Bei dem Fötus einer 34-jährigen Chinesin wurde in der 16. Schwangerschaftswoche mittels Ultraschall ein doppelter Aortenbogen und eine linke A. subclavia vermutet.Während der vorherigen dichorialen diamniotischen Zwillingsschwangerschaft der Patientin hatte ein Fötus einen doppelten Aortenbogen und eine Lippenspalte mit selektivem Fetozid (Abb. 3a).Trio WES für Indexschwangerschaft zeigte eine de novo heterozygote Spleißvariante NM_017780.4:c.7164 + 1 G > A in CHD7 (MIM 608892).Dieselbe Variante war auch bei dem zuvor betroffenen Fötus durch Sanger-Sequenzierung identifiziert worden, bei der weitere Tests später bestätigten, dass die Variante durch väterliches Keimbahnmosaik verursacht worden war.CHD7 ist mit dem CHARGE-Syndrom (MIM 214800) assoziiert.Gemäß den Richtlinien zur Varianteninterpretation des American College of Medical Genetics (ACMG) wird diese Spleißvariante als wahrscheinlich pathogen eingestuft (PVS1_Moderate, PS2 und PM2).Obwohl die Variante in der Literatur beschrieben wurde, bleiben die molekularen Folgen des Überspringens von Exon 33 oder der Schaffung einer alternativen Spleißstelle innerhalb von Intron 33 ungewiss42.a Stammbaum für Familie 1. b Sashimi-Plot von Integrative Genome Viewer (IGV), der das Skipping von Exon 33 ohne alternative Spleißstelle in Intron 33 für beide betroffenen Föten im Vergleich zu einer Kontrolle zeigt.Nur eine (obere) Linie erstreckte sich von Exon 32 bis 34. Die Position der Variante ist mit einem Stern gekennzeichnet.c RT-PCR-Ergebnisse mit Primerpaaren, die sich über die Exons 32 bis 34 erstrecken und die erwartete Größe von 827 bp zeigen.Die erwartete Größe für die Deletion von Exon 33 = 600 bp, was ein heterozygotes Skipping von Exon 33 in den Föten 1 und 2 zeigt. Die quadratischen Kästchen auf der rechten Seite geben die Exonnummer an.d Expressionsrangdiagramme für drei Gene der SOX-Familie.Die X-Achse stellt alle 52 AF-Zellen dar, angeordnet in aufsteigender Reihenfolge der normalisierten Lesezahlen im entsprechenden Gen.Die Y-Achse repräsentiert die normalisierten Lesezählungen.NM_017780.4:c.7164 + 1 G > A in CHD7 könnte die Expression nachgeschalteter Gene wie SOX4, SOX9 und SOX11 beeinflussen, da diese Gene in Föten 1 und 2 im Vergleich zu allen 52 Proben weniger exprimiert wurden.Der rote Punkt/Pfeil zeigt eine abweichende Expression dieses SOX11 (FDR ≤ 0,05) in Fötus 1 an.DROP ergab 11 Ausreißer beim abweichenden Spleißen (AS) für jeden Fötus (Ergänzungstabelle 7).CHD7 wurde bei beiden betroffenen Feten als Spleißausreißer nachgewiesen (|Δψ| von 0,62 bei Fetus 1 und 0,66 bei Fetus 2 [FDR ≤ 0,05]).Unsere RNA-seq-Daten zeigten, dass Exon 33 ohne alternative Spleißstelle in Intron 33 übersprungen wurde (Abb. 3b).Dies deutete auf die Synthese eines verkürzten, teilweise oder nicht funktionellen CHD7 hin.Diese Befunde wurden durch RT-PCR unter Verwendung von Primerpaaren bestätigt, die sich über Exons 32–34 erstrecken (Abb. 3c).Durch die Integration der kürzlich aktualisierten Richtlinien für die klinische Interpretation der Pathogenität von Varianten unter Verwendung von RNA-seq-Daten von Smirnov et al.43 können PS3-Evidenz nach RNA-seq von AF-Zellen verwendet werden, um die Variante von wahrscheinlich pathogen zu pathogen hochzustufen.DROP ergab zwei Ausreißer der aberranten Expression (AE) für Fötus 1 und einen Ausreißer der Expression für Fötus 2 (Ergänzungstabelle 8);bei Fötus 1 war jedoch nur SOX11 klinisch relevant. Die Expression von CHD7 war mit einem mittleren TPM-Wert von 4,5 für Fötus 1 und 2,4 für Fötus 2 gering (ergänzende Abb. 5a).Da CHD7 für einen ATP-abhängigen Chromatin-Modifikator kodiert, der an der Transkriptionsregulation während der frühen Stadien der Entwicklung verschiedener Gewebe beteiligt ist44, könnte die Spleißstellenvariante möglicherweise zu einem Funktionsverlust von CHD7 als Chromatin-Remodeler und Gentranskriptionsregulator führen.In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen, dass CHD7 und nachgeschaltete Gene die Hauptursachen des CHARGE-Syndroms sind45,46, zeigten unsere RNA-seq-Daten, dass die Expression von SOX4, SOX9 und SOX11 in beiden Föten zu den niedrigsten der gesamten Kohorte gehörte (Abb. 3d ).Verschiedene Mitglieder der SOX-Familie werden von CHD747 reguliert.SOX4 und SOX11 sind bekannte direkte Ziele von CHD748, und der CHD7/SOX9-Signalweg ist wesentlich für die Spezifizierung und Migration von Neuralleistenzellen (NCC)49.Eine aktuelle Transkriptomstudie von Yan et al.(2020) zeigten auch, dass CHD7 die Expression eines Gennetzwerks feinabstimmt, das für die Entwicklung kardialer NCCs entscheidend ist50, was mit der Hypothese übereinstimmt, dass die klinischen Merkmale von CHARGE aus der abnormalen Entwicklung von NCCs resultieren können.Dies würde den abnormalen kardialen Phänotyp des Patienten erklären.Es sind jedoch weitere Knockout-Funktionsstudien erforderlich, um die genauen Mechanismen zu validieren, die dem doppelten Aortenbogen zugrunde liegen.Der Fötus einer 36-jährigen Chinesin wies im Ultraschall während der Schwangerschaft eine Aortenisthmusstenose, ein hypoplastisches linkes Herz und einen Zwerchfellbruch auf.Die Familie entschied sich für einen medizinischen Abbruch post mortem, der einen beidseitigen angeborenen Zwerchfellbruch, eine Lungenhypoplasie, einen doppelten rechten Ventrikel, einen Ventrikelseptumdefekt und zweideutige äußere Genitalien aufwies.Trio WES enthüllte eine de novo heterozygote MYRF (MIM 608329) Spleißvariante in NM_001127392.1:c.2014-1 G > A, die mit dem kardio-urogenitalen Syndrom (MIM 618280) assoziiert war und autosomal-dominant vererbt wurde.Gemäß den ACMG Variant Interpretation Guidelines wurde diese Spleißvariante als pathogen (PVS1, PS2 und PM2) eingestuft und bisher nicht gemeldet;daher bleiben seine molekularen Mechanismen unbekannt.Ein In-silico-Tool sagte eine Unterbrechung des Leserahmens voraus, die zu Nonsense-Mediated Decay (NMD) führen würde.DROP ergab sieben Spleißausreißer für diese Probe ohne Expressionsausreißer (Ergänzungstabellen 7 und 8).MYRF wurde als AS-Ausreißer erkannt (|Δψ| bei 0,31, FDR ≤ 0,05).Die RNA-seq-Daten zeigten, dass diese Variante nicht nur eine vollständige Retention von Intron 14 verursachte, was in einigen Transkripten zu NMD führte, sondern auch eine In-Frame-69-bp-Retention von Intron 14 in anderen Transkripten verursachte ( 4a , b), was die funktionelle Konsequenz, die vom In-Silico-Tool vorhergesagt wird.Dieses fehlerhafte Spleißen führte zu einem abnormalen MYRF-Protein mit 1) 23 zusätzlichen Aminosäuren zwischen p.671–672 und 2) einer Verkürzung aufgrund eines STOP-Codons innerhalb von Intron 14. Diese Merkmale könnten die intramolekulare Chaperondomäne lahmgelegt und die Autospaltung blockiert haben von MYRF, wie zuvor für die Variante NM_001127392.2:c.2036 T > C p.Val679Ala51 berichtet.RT-PCR bestätigte das Vorhandensein längerer MYRF-Transkripte (Fig. 4c).TA-Klonierung und Sanger-Sequenzierung bestätigten die In-Frame-Insertion an den Positionen c.2014-69 bis c.2014-1.a Sashimi-Plot und b IGV-Profil, das eine In-Frame-69-bp-Intron-14-Retention und eine vollständige Intron-14-Retention zeigt, aktiviert durch NM_001127392.1:c.2014-1 G > A. Dies wurde in einer anderen AF-Zellkontrolle nicht beobachtet .Die Splicing-Variante fehlte auch in gnomADv2.1.1.Der Standort der Variante wurde mit einem Stern gekennzeichnet.c RT-PCR mit Primerpaaren, die die Exons 14 bis 17 umfassen, mit einer erwarteten Größe von 364 bp für den Wildtyp und 433 bp für das Transkript mit partieller Intronretention.Die quadratischen Kästchen auf der rechten Seite geben die Exon-Nummer an.NM_001127392.1:c.2014-1 G > A enthielt eine In-Frame-Variante, die die MYRF-mRNA-Expression nicht beeinflusste (Ergänzende Abb. 5b).Myelin-Gene wie MBP, MOG, MAG, DUSP15 und PLP1 werden während der Oligodendrozyten-Reifung durch MYRF aktiviert52;Da die Expression dieser Myelin-Gene in AF-Zellen, Fibroblasten und Vollblut jedoch gering war, konnten wir nicht feststellen, ob die Funktionalität von MYRF beeinträchtigt war.Weitere nachgelagerte Proteinstudien oder RNA-seq in verschiedenen Gewebetypen sind erforderlich, um die detaillierten Mechanismen der Krankheit zu verstehen;Die Probenauswahl ist jedoch insbesondere in der Pränataldiagnostik normalerweise begrenzt.Bei einer 47-jährigen schwangeren Chinesin, die sich für eine In-vitro-Fertilisation mit einer Spendereizelle entschieden hatte, wurde ein Screening-Testergebnis für das Down-Syndrom im ersten Trimester mit hohem Risiko festgestellt.Ein Anomalie-Ultraschall-Scan zeigte Akromelie, Kontrakturen (Arthrogryposis) und kurze lange Knochen.Nach medikamentösem Schwangerschaftsabbruch zeigte die Röntgenuntersuchung des Abortes eine Hypomineralisation des Schädelknochens mit Frakturen der Röhrenknochen.Das Duo WES des Fötus und des biologischen Vaters zeigte eine heterozygote Spleißvariante (NM_000089.3:c.2133 + 5 G > A) in COL1A2 (MIM 120160), die mit Osteogenesis imperfecta Typ II (MIM 166210) assoziiert war.Diese Spleißvariante wurde gemäß den Richtlinien der ACMG Variant Interpretation als VUS (PM2 und PM6) klassifiziert.NM_000089.3:c.2133 + 5 G > A in COL1A2 wurde bisher nicht beschrieben, und seine molekularen Mechanismen bleiben unbekannt.DROP ergab 15 Spleißausreißer für diese Probe ohne Expressionsausreißer (Ergänzungstabellen 7, 8).COL1A2 wurde als Spleiß-Ausreißer erkannt (|Δψ| bei 0,59, FDR ≤ 0,05).RNA-seq-Daten bestätigten, dass diese Variante das Überspringen von Exon 35 (Fig. 5a) mit der gleichen Folge verursachte, wie sie für c.2133 + 6 G > A53 berichtet wurde.TA-Klonierung und Sanger-Sequenzierung bestätigten das Überspringen von Exon 35 (Abb. 5b).Mit diesem neuen Nachweis aus der RNA-seq-Analyse von VHF-Zellen zusammen mit den kürzlich aktualisierten Richtlinien43 kann NM_000089.3:c.2133 + 5 G > A als pathogen und nicht als VUS (PS3, PM2, PM4 und PM6) betrachtet werden.ein Sashimi-Diagramm, das das Überspringen von Exon 35 zeigt. Die Position der Variante ist mit einem Stern gekennzeichnet.b RT-PCR mit Primerpaaren, die die Exons 32 bis 37 überspannen, mit einer erwarteten Größe von 319 bp für den Wildtyp und 265 bp für das Transkript mit der Deletion von Exon 35.Die quadratischen Kästchen auf der rechten Seite geben die Exon-Nummer an.NM_000089.3:c.2133 + 5 G > A beeinflusste weder die mRNA-Expression von COL1A2 (Ergänzende Abb. 5c) noch die Expression von Genen, die mit der Knochenentwicklung in Verbindung stehen, wie RETN, FCGR3B, ALPL, AEBP1 und LIMS2.Da jedoch nicht alle dieser mit der Knochenentwicklung zusammenhängenden Gene in AF-Zellen gut exprimiert werden (nur eines dieser fünf Gene wurde als in AF-Zellen gut exprimiert angesehen);Weitere funktionelle Studien mit anderen Gewebetypen sind erforderlich, um die genauen Mechanismen der Variante zu beschreiben.In den letzten Jahren hat sich RNA-seq zu einem wichtigen Werkzeug in der genetischen Diagnostik entwickelt, da es zur Interpretation von VUS ungelöst durch WES oder WGS beiträgt.Blut16,17,18,19,20, Hautfibroblasten6,15,17,18,19,21 und Muskel14,15,17 sind die am häufigsten verwendeten klinisch zugänglichen Gewebe.Hautfibroblasten werden bevorzugt, da sie im Vergleich zu Blut einen hohen Anteil an exprimierten Genen erfassen können18.Fibroblasten erfordern jedoch invasive Hautbiopsien und sind daher nachteilig.Die verfügbare Probenauswahl ist in der Pränataldiagnostik begrenzt.Die gebräuchlichsten pränatalen Diagnosetechniken sind Amniozentese, CVS und in geringerem Maße fetale Blutentnahmen54.Enzensberger et al.55 analysierten retrospektiv 6256 Patientinnen, die sich zwischen 1993 und 2011 einer invasiven Diagnostik unterzogen, und fanden eine prozedurbedingte fetale Verlustrate von 0,4 % nach Amniozentese und von 1,1 % bzw. 0,4 % nach CVS und FBS.Da die Amniozentese ein geringes Fehlgeburtsrisiko darstellt und in den meisten pränatalen Diagnoselabors ein Routineverfahren ist, ist die Entnahme von AF-Proben für die pränatale RNA-Seq.Wir haben die Verwendung von AF-Zellen als klinisch zugängliches Gewebe für RNA-seq in der Gendiagnostik evaluiert.Wir haben gezeigt, dass Amniozyten aufgrund ihres ähnlichen embryonalen Ursprungs ein ähnliches Genexpressionsprofil wie Fibroblasten haben.Die Anzahl gut exprimierter Gene in AF-Zellen war vergleichbar mit der in Fibroblasten und viel höher als die in Vollblut in verschiedenen Krankheitskategorien.Der Vorteil der RNA-seq von AF-Zellen wurde in Familie 1 weiter veranschaulicht, in der wir herausfanden, dass die CHD7-Spleißvariante nachgeschaltete SOX-Familien wie SOX9 beeinflusste.Informationen zu SOX9 können nur bei Verwendung von AF-Zellen gewonnen werden, da dieses Gen nicht im Blut oder in Fibroblasten exprimiert wird.In ähnlicher Weise konnten transkriptomische Informationen zu MYRF in Familie 2 nur unter Verwendung von AF-Zellen untersucht werden (Ergänzung 5B).Obwohl COL1A2 in Fibroblasten in Familie 3 stark exprimiert wurde, mit einem medianen TPM-Wert von > 4000, wurde es auch in AF-Zellen mit einem medianen TPM-Wert von 37 gut exprimiert. Dieses Gen wurde jedoch kaum in Vollblut exprimiert, mit a mittlerer TPM-Wert von 0,62 (ergänzende Abb. 5c).Wie in einer früheren Studie18 zeigte unser PCA-Diagramm eine geringere Variabilität in Fibroblasten als im Blut.Darüber hinaus beobachteten wir eine geringere Variabilität in AF-Zellen, was darauf hindeutet, dass sowohl AF-Zellen als auch Fibroblasten robuste und konsistente Ergebnisse für die klinische Diagnostik liefern können.Unter Verwendung von RNA-seq von AF-Zellen mit einer kürzlich etablierten analytischen Pipeline, DROP, haben wir erfolgreich die krankheitsverursachenden Gene CHD7, MYRF und COL1A2 als signifikante Spleißausreißer in drei Familien nachgewiesen (Abb. 3–5).Die Begründung dieses Ansatzes basiert auf dem Vergleich einer Patientenprobe mit den übrigen Proben in der Kohorte als interne Kontrollen.Daher wurde die Lesetiefe der Sequenzierung dieser Studie mit 100 Millionen Lesevorgängen angestrebt, um anomale Ausreißer richtig zu erkennen22,43.Dieser Vergleich ermöglicht die Identifizierung signifikanter aberranter Ausreißer, AE, AS und monoallelischer Expression (MAE), die sich aufgrund der ursächlichen genetischen Defekte in einer Probe abheben.Gene mit kausalen Varianten werden nicht notwendigerweise von allen drei Pipelines (AE, AS und MAE) aufgenommen.Während wir die Fähigkeit von AF-Zellen-RNA-seq und unserer angepassten DROP v1.1.0-Pipeline demonstrierten, pathogene Spleißvarianten in drei Familien zu identifizieren, wird ihre entsprechende Expression nicht beeinträchtigt.Laut einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung von Smirnov et al.43, die einen Überblick über acht neuere Studien mit großangelegter RNA-seq gab, wurden 64 %, 62 % und 27 % der diagnostizierten Fälle durch AE, AS bzw. MAE identifiziert, die Hälfte davon Splicing-Ausreißer führten nicht zu einer abweichenden Expression.Darüber hinaus konnte der Nachweis als Expressionsausreißer nur einen starken Beweis für die Pathogenität in biallelischen Splice-Varianten, nicht aber in monoallelischen Splice-Varianten liefern;daher ist für eine monoallelische Spleißvariante eine abnormale Expression keine nützliche funktionelle Konsequenz, um ihre Pathogenität zu unterstützen.Andererseits könnte der Nachweis als Spleiß-Ausreißer einen starken Beweis für die Pathogenität gegenüber monoallelischen Spleißvarianten liefern.Kürzlich wurden Anstrengungen unternommen, RNA-seq-Evidenz in die ACMG-Richtlinien zur Interpretation von Varianten aufzunehmen43,56,57.Unter Verwendung eines Satzes von 723 gutartigen Varianten und 198 pathogenen Varianten mit bekannten aberranten RNA-Phänotypen wie abweichendem Spleißen oder Expression, haben Smirnov et al.berechneten die Wahrscheinlichkeit der Pathogenität, um verschiedene Schwellenwerte für die Bewertung der Pathogenitätsstärke von Varianten zu bewerten, mit dem Ziel, Daten aus DROP in die ACMG-Richtlinien zur Interpretation von Varianten zu integrieren43.Gemäß ihrer Empfehlung identifizierten wir CHD7, MYRF und COL1A2 als signifikante Spleißausreißer basierend auf Effektgröße und Signifikanzschwelle (CHD7: |Δψ| =0,63/0,66, FDR ≤ 0,05; MYRF: |Δψ| =0,31, FDR ≤ 0,05; COL1A2: |Δψ| = 0,59, FDR ≤ 0,05), was einen starken funktionellen Beweis (PS3) liefert, um die Pathogenität der in diesen Genen identifizierten Spleißvarianten zu unterstützen.Durch Integrieren des obigen Schwellenwerts in unsere Fälle können die in den Familien 1 und 3 beobachteten Spleißvarianten weiter zu pathogen hochgestuft werden.Außerdem überarbeitete die RNA-seq von AF-Zellen die funktionellen Folgen der Intronretention für die MYRF-Variante und zeigte, dass die In-silico-Vorhersage nicht 100 % genau ist.Wir fanden heraus, dass AF-Zellen mit Genen angereichert waren, die an der frühen Entwicklung beteiligt sind, insbesondere Herz, da es das erste funktionierende Organ bei der Entwicklung von Embryonen ist58.Die GO-Ergebnisse stimmten mit unserer Feststellung überein, dass AF-Zellen die bessere Wahl unter den klinisch zugänglichen Geweben für die Untersuchung von VUSs im Zusammenhang mit angeborenen Herzerkrankungen sein könnten, da AF-Zellen eine große Anzahl gut exprimierter kardialer Gene aufweisen (Ergänzende Abb. 3a , 4a).Obwohl die Ausweitung der Genexpressionsanalyse auf ein kardiales Entdeckungspanel (n = 1628) mit bekannten oder potenziellen Assoziationen mit der Herzentwicklung und der Herzmuskelstruktur59 keine bessere Leistung von AF-Zellen als Hautfibroblasten zeigte, waren ihre Ergebnisse mit der Expression von AF-Zellen vergleichbar 52 % und Fibroblasten, die 56 % der stark exprimierten Gene exprimieren.Nach unserem besten Wissen ist dies eine bahnbrechende Proof-of-Concept-Studie, um die klinische Nützlichkeit von AF-Zellen-RNA-seq als pränatales diagnostisches Instrument und für die Interpretation von VUSs zu demonstrieren.Unsere Studie unterstreicht den Vorteil der Aufbewahrung von VHF nach vorgeburtlichen Untersuchungen, um diese bei Bedarf auch für die postnatale Gendiagnostik nutzen zu können.Darüber hinaus kann angesichts der Multipotenz von Stammzellen (SCs) von AF, sich in alle embryonalen Keimlinien zu differenzieren60, die Lagerung von AF dazu beitragen, die Folgen der Krankheit aufzuklären und Kandidatengene zu validieren.Daher kann die Aufbewahrung von AF SCs potenzielle therapeutische Auswirkungen in der Zukunft haben61.Synchron mit der Initiative Developmental Genotype-Tissue Expression (dGTEx) (https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Developmental-Genotype-Tissue-Expression) des National Human Genome Research Institute (NHGRI). RNA-seq wird an ganzen Geweben und an Einzelzell- oder homogenen Zellpopulationen durchgeführt, die von neonatalen und pädiatrischen Spendern in einer postmortalen Umgebung gesammelt werden, sowie an anderen Studien, die die Einzelzelltechnologie zur Profilierung von Genexpressionsmustern während der pränatalen Phase verwenden62,63 ,64, our data will serve as early preliminary data in the field until the dGTEx is fully developed and accessible in 2026. Over 85% of individuals in the GTEx are of European descent25.Int.Am besten.